1843年，19岁的巴斯德以优异的成绩考上了巴黎高等师范学校化学系。坚强的父母变卖了家里所有值钱的东西，凑足了儿子的学费。巴斯德含泪离开了父母，来到了巴黎求学。巴斯德的大学生活过得十分艰苦。为了减轻家里的负担，他去给有钱人家当家庭教师。但是雇主却十分苛刻，他要求巴斯德每天必须按规定时间上课，迟到一分钟就扣除他的工资。巴斯德白天上课，放学后胡乱吃点东西便去教书。每天做完家教回到学校是他最高兴的一段时间，因为这时候他便可以读书了，他每天都要学习到很晚。凭着顽强的毅力，巴斯德用了两年的时间便拿下了化学学士学位，两年后又获得了硕士学位。
1847年，巴斯德研究生毕业后留校任教，此后他致力于化学研究。他倾心于酒石酸和异酒石酸的研究，这两种晶体的元素构成和晶体形状完全相同，不过前者有旋光性，后者没有。这两种晶体的差异性秘密，当时的化学家们一直没有破解。巴斯德下决心一定要攻克这个难题，他夜以继日地进行着科学研究。功夫不负有心人，经过两年的刻苦钻研，1849年，他终于揭开了异酒石酸无旋光性的秘密。这一研究成果在当时的科学界引起了轰动，不满30岁的巴斯德成了法国科学界备受关注的人物。
